Baeyer synthetisiert wurde, indem er Harnstoff mit Malonsäure kondensierte.
Bei einer etwas einfacheren Methode wird der Diethylester der Malonsäure (Malonsäurediethylester) verwendet, der mit Harnstoff unter Einsatz von Natriumethanolat als Katalysator reagiert. Durch die Auflösung von metallischem Natrium in reinem Alkohol (Ethanol) entsteht eine Base.
Die Synthese lässt sich folgendermaßen darstellen:
Die Reaktion erfolgt über mehrere Stunden bei 110°C unter Verwendung eines Rückflusskühlers. Durch Ansäuerung der Mischung erhält man Kristalle von Barbitursäure, welche durch Filterung und anschließende Abkühlung des Filtrats separiert werden. Barbitursäure selbst hat jedoch keinen physiologischen Effekt und muss weiterverarbeitet werden, damit ein Barbiturat entsteht, das sich als sanftes Sterbemittel eignet. Die sedativen, hypnotischen und anästhetischen Eigenschaften der Barbiturate werden nämlich durch zwei zusätzliche Seitenketten am Barbitursäuremolekül bestimmt.
Die in diesem Zusammenhang besonders interessanten disubstituierten Barbiturate sind Amylobarbital (z. B. im Medikament Amytal enthalten) und Pentobarbital (z. B. in Nembutal enthalten). Die beiden Seitenketten müssen vor der Kondensation von Malonsäure und Harnstoff angehängt werden (Disubstitution).